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第1章　基因工程技术 1

1.1　基因工程技术基本原理与实践 1

1.1.1　基因工程简述 1

1.1.2　基因工程技术实践 2

1.2　原核生物基因工程技术 6

1.2.1 目的DNA的获得 6

实验1　细菌基因组DNA的制备 7

实验2　植物基因组DNA的制备和分析 8

实验3　动物细胞基因组DNA的制备 10

实验4　PCR扩增目的DNA 11

1.2.2　大肠杆菌质粒载体的制备 16

实验5　碱裂解法 17

实验6　小量一步提取法 19

实验7　试剂盒法 19

1.2.3　载体和目的DNA的限制酶消化 20

实验8　基因组DNA的限制酶消化 21

实验9　质粒载体的限制酶消化 21

实验10　DNA片段的回收纯化 23

1.2.4　载体与目的基因的体外重组 25

实验11　载体和目的基因的体外重组 26

实验12　PCR产物的TA重组 26

1.2.5　重组质粒导入大肠杆菌 29

实验13　CaCl2介导转化法 30

1.2.6　转化菌落的筛选 32

实验14　PCR法快速筛选阳性克隆 33

实验15　菌落原位杂交 34

1.3　真核生物（酵母）的基因工程 37

实验16　酵母基因组DNA的提取 38

实验17　酵母细胞质粒DNA的分离 39

实验18　酵母细胞的转化 40

实验19　酵母单杂交 42

主要参考文献 44

第2章　蛋白质工程技术 46

2.1　蛋白质工程技术原理 46

2.2　蛋白质工程技术 47

2.2.1　重组蛋白质的表达 47

实验1 重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达 49

实验2　重组蛋白在酵母中的诱导表达 51

2.2.2　重组表达蛋白的分离纯化 53

实验3　金属螯合层析法纯化带组氨酸标签的蛋白质 54

实验4　谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析纯化融合蛋白 57

实验5　从包含体中纯化表达蛋白 59

实验6　利用凝胶过滤层析更换缓冲液 62

2.2.3　蛋白质溶液的浓缩 64

实验7　超滤法浓缩蛋白质溶液 65

实验8　透析法浓缩蛋白溶液 67

2.2.4　蛋白质浓度测定 68

实验9　Bradford检测法 68

实验10　Lowry检测法 70

2.2.5　蛋白质鉴定方法 71

实验11　蛋白质的SDS-PAGE 71

实验12　双向聚丙烯酰胺凝胶电泳 74

实验13　蛋白质印迹 82

2.2.6　蛋白质的定点突变 85

实验14　重叠延伸产生特异位点突变 85

主要参考文献 88

第3章　植物细胞工程技术 89

3.1　植物细胞工程原理 89

3.2　植物细胞工程技术 90

3.2.1　植物组织培养技术 90

实验1　植物组织培养常用培养基的配制及灭菌 91

实验2　烟草组织快繁技术 95

实验3　植物细胞悬浮培养技术 96

3.2.2　植物原生质体分离与细胞融合技术 99

实验4　烟草叶片原生质体的分离与培养 100

3.2.3　植物体细胞杂交 105

实验5　电激法诱导植物原生质体融合 106

实验6　聚乙二醇诱导植物原生质体融合 107

3.2.4　植物转基因技术 109

实验7　叶盘法转化烟草 111

实验8　真空渗入法转化拟南芥 114

实验9　基因枪转化水稻愈伤组织 117

3.2.5　转基因植物的鉴定 120

实验10　外源基因整合的鉴定——斑点杂交 121

实验11　利用Southern杂交检测外源基因的整合 124

实验12　植物组织总RNA的提取 128

实验13　利用RT-PCR初步检测外源基因在植物体内的表达 129

实验14　利用实时荧光定量RT-PCR定量检测外源基因在植物体内的表达 132

实验15　gus基因检测 136

主要参考文献 138

第4章　动物细胞工程技术 139

4.1　动物细胞工程技术原理 139

4.2　动物细胞工程技术 140

4.2.1　细胞培养的准备工作及基本操作 140

实验1　细胞培养的前期工作 140

实验2　细胞培养基的配制 143

实验3　细胞计数及活力测定 148

实验4　细胞传代培养（胰蛋白酶消化法） 151

实验5　细胞的冻存和复苏 154

4.2.2　原代细胞的培养 158

实验6　从小鼠胚胎中分离鼠胚胎成纤维细胞 158

实验7　从鸡胚胎中分离背根神经节细胞 160

4.2.3　细胞系的建立和培养 162

实验8　原代鼠胚胎成纤维细胞的永生化 162

实验9　细胞系的培养 164

4.2.4　DNA导入哺乳动物细胞 166

实验10　与磷酸钙形成共沉淀的DNA转染技术 167

实验11　脂质体介导的DNA转染技术 169

实验12　用电穿孔法导入DNA 172

实验13　运用显微注射法导入DNA 175

4.2.5　检测基因产物的表达 177

实验14　利用绿色荧光蛋白观察特定融合蛋自在细胞内的动态分布 177

实验15　用免疫荧光技术检测特定蛋自质在细胞中的定位 180

实验16　用免疫共沉淀法和免疫印记法检测蛋白质之间的相互作用 183

实验17　用流武细胞仪分析细胞周期的交化 186

实验18　利用双萤光素酶作为报告基因来检测启动子的活性和调控 190

主要参考文献 196

第5章　微生物工程技术 197

5.1　微生物工程技术原理 197

5.1.1　微生物工程的定义 197

5.1.2　微生物工程的研究内容 198

5.1.3　微生物工程的发展历史 198

5.1.4　发酵工业的特点 200

5.1.5　微生物工程的应用 200

5.1.6　我国发酵工业发展概况 201

5.2　微生物工程技术 202

实验1　菌种的自然选育 202

实验2　土壤中放线菌的选择性分离 205

实验3　发酵菌株的初筛 208

实验4　微生物菌种的保藏 210

实验5　发酵菌种的诱变选育 216

实验6 四环素的定向发酵及效价测定 219

实验7　竹黄菌液体发酵及其活性物质的提取 226

实验8　淀粉质原料的酒精发酵 229

实验9　生长曲线和产物形成曲线的测定 236

实验10　发酵过程中糖的利用 238

实验11　抗生素的分离纯化 240

实验12　发酵污染的检测和判断 242

实验13　酸乳的发酵 244

主要参考文献 248