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目录 1

引言和背景 1

第一部分　分子生物学 9

实验一 11

微量移液器使用指南 11

实验二 17

质粒DNA模板的制备 17

（2）PCR扩增质粒DNA的LTB基因 24

（1）测定质粒DNA浓度 24

实验三 24

实验四 36

（1）琼脂糖凝胶电泳 36

（2）PCR产物回收 36

实验五 43

（1）限制性内切酶酶切LTB插入基因和载体 43

（2）平板制备 43

（2）酶切后插入基因片段和载体的回收 50

（1）琼脂糖凝胶电泳法纯化酶切后的插入基因片段和载体 50

实验六 50

实验七 56

（1）DNA浓度测定 56

（2）插入基因与载体的连接 56

实验八 63

重组体转化宿主细胞 63

（3）接种培养物／PCR反应／分离质粒 70

（2）用可能的重组子划线平板 70

（1）挑取菌落，PCR检测插入片段 70

实验九 70

实验十 75

（1）琼脂糖凝胶电泳检测插入基因 75

（2）用质粒少量制备试剂盒纯化pET28LTB 75

实验十一 80

（1）DNA浓度检测 80

（2）乙醇沉淀质粒DNA 80

（3）测序反应 80

（2）测序凝胶示范 87

实验十二 87

（1）纯化延伸反应产物 87

实验十三 91

（1）分析序列数据 91

（2）验证插入序列 91

实验十四 98

（1）基因表达 98

（2）表达宿主的转化 98

诱导LTB基因表达：测定最大表达的时间 104

实验十五 104

第二部分　蛋白质化学 109

实验十六 111

（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析诱导时间过程 111

（2）用Western blot将蛋白质转移至膜上 111

实验十七 120

Western Blot的显像 120

实验十八 125

大规模培养物的制备 125

亲和层析法分离LTB 130

实验十九 130

实验二十 134

（1）柱层析分段物的SDS-PAGE鉴定 134

（2）免疫印迹检验LTB的存在 134

实验二十一 140

蛋白质浓缩和结晶 140

实验二十二 147

准备ELISA微量滴定板来分析系列神经苷脂配体 147

实验二十三 153

用ELISA分析系列神经节苷脂配体 153

实验二十四 161

蛋白质结构测定：X射线衍射技术 161

实验二十五 168

用X射线衍射分析蛋白质晶体的特征（可任选） 168

实验二十六 169

引物设计 169

索引 173