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目录 1

实验计划表 1

导论 4

1　基因文库的构建 18

1-1 染色体DNA的提取 18

1-2 总RNA和mRNA的提取 25

1-3　λ噬菌体DNA的提取 33

1-4 染色体DNA的部分消化 38

1-5　基因组文库的构建 40

1-6　cDNA合成 44

1-7 cDNA文库的构建 49

2 目的基因的获得 55

2-1 PCR扩增及RT-PCR 55

2-2 核酸电泳 64

2-3　核酸探针的标记及检测 69

2-4　核酸探针筛选基因文库 77

3　载体质粒的制备 82

3-1 质粒DNA的提取与纯化 82

3 2 核酸纯度、浓度与相对分子质量的测定 90

4　扩增质粒的构建 94

4-1 限制性内切酶的酶切反应 94

4-2　凝胶电泳法进行DNA的分离、提纯 100

4-3　DNA片段的体外连接 103

5 重组DNA导入宿主细胞 107

5-1　感受态细胞的制备 107

5-2　重组质粒的转化 111

6-1 阳性克隆的筛选 117

6　重组子的筛选与鉴定 117

6-2　测序与序列同源性分析 122

6-3　Southern印迹 127

7　表达质粒的构建与诱导表达 134

7-1　表达质粒的构建 134

7-2 Northern印迹 140

7-3　外源基因的诱导表达 145

7-4 SDS-PAGE 149

7-5　Western印迹 155

7-6　酶联免疫吸附测定（ELISA） 160

7-7　蛋白质生物功能测定法 162

8　工程菌的培养与目标产物分离 164

8-1　发酵条件的优化 164

8-2　诱导表达蛋白质的分离沉淀 166

8-3　凝胶过滤层析 172

8-4　离子交换层析 180

8-5　蛋白质浓度的测定 186

8-6　酶活性的测定 189

8-7　分离纯化蛋白的收率计算与保存 191

参考文献 193

附录1 简写 194

附录2　实验注意事项 197

附录3　如何撰写实验报告 199

附录4　常用的碱基、氨基酸符号及缓冲液 201

附录5　大肠杆菌基因型 204

附录6　培养基与试剂的配制 205

附录7　实验仪器 212