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1 DNA的制备和分析 1

1.1 细菌质粒的制备 2

1.1.1 碱裂解法 2

1.2.1 酵母细胞质粒DNA的分离 3

1.1.2 煮沸法 4

1.1.3 小量一步提取法 4

1.1.4 DNA制备试剂盒 5

1.2 酵母DNA的制备 6

1.2.2 酵母染色体DNA的提取 8

1.2.3 醋酸锂法转化酵母细胞 9

1.2.4 电击转化酵母细胞 10

1.3.1 植物细胞核基因组DNA的提取与纯比 13

1.3 植物DNA的制备 13

1.3.2 植物线粒体基因组DNA的提取 18

1.3.3 植物叶绿体基因组DNA的提取 21

1.4 cDNA文库入重组DNA的提取 25

1.4.1 大量制备λDNA 25

1.4.2 小量制备λDNA 26

1.5 质粒DNA电镜制样技术 27

1.6 植物根尖细胞核染色质层层技术 31

1.7 DNA、RNA的定量测定及分析 33

1.7.1 紫外吸收法测定核酸含量 33

1.7.2 二苯胺显色法测定DNA含量 34

1.7.3 地衣酚显色法测定RNA含量 35

1.7.4 定磷法测定核酸含量 36

2 DNA克隆 38

2.1 DNA的酶切 41

2.2 DNA片段的纯化回收 43

2.2.1 低熔点胶法 44

2.2.2 玻璃奶(Giassmilk)法 44

2.2.3 DNA回收试剂盒法 44

2.2.4 冻融法 45

2.3 DNA的重组、转化和蓝白筛选 45

2.4 Southern印迹杂交 48

2.4.1 同位素标记探针的分子杂文 49

2.4.2 DIG标记探针的分子杂交 51

2.5 菌落或噬菌斑的原位杂交 55

2.6 DNA序列分析 57

3 RNA的制备和分析 62

3.1 植物组织总RNA的制备 63

3.1.1 异硫氰酸胍(GIT)-氯化铯(CsCl)超离心法 63

3.1.2 异硫氰酸胍-酚法 64

3.1.3 热酚法 65

3.2 RNA的定量和完整性分析 66

3.2.1 甲醛变性电泳检测RNA完整性 66

3.2.2 紫外分光光度计测定RNA含量和纯度 67

3.3.1 Oligo(dT)纤维素亲和层析法 69

3.3 mRNA的分离和纯化 69

3.3.2 磁珠法 70

3.4 Northern印迹杂交 73

3.5 液体闪烁计测定法 80

3.6 转录起始位点的测定 82

3.6.1 核酸酶Sl保护分析法 82

3.6.2 RNA酶保护分析法 85

3.6.3 引物延伸分析法 86

3.7 行进转录分析 88

4 cDNA文库的构建 92

4.1 λZAP+ExpresscDNA文库的构建 93

4.1.1 cDNA的合成及修饰 95

4.1.3 λ重组DNA的体外包装 97

4.1.2 体外重组DNA 97

4.1.4 λ噬菌体的转染 98

4.1.5 体内剪切 98

4.2 扣除文库的构建 101

4.2.1 RNA制备 103

4.2.2 mRNA的提取 103

4.2.3 mRNA样品的DNase I处理 104

4.2.4 Tester样品cDNA第一链的合成 104

4.2.5 mRNA的水解 105

4.2.6 DNA/RNA溶液杂交 106

4.3 利用LD—合成cDNA及cDNA文库的构建 106

4.2.7 DNA/RNA铰链 107

4.2.8 扣除cDNA的克隆 107

4.3.1 cDNA的合成 112

4.3.2 cDNA文库的构建 115

4.3.3 转变λTriplEx2成为TriplEx2质粒 117

5 PCR相关技术 119

5.1 PCR技术 120

5.1.1 基础PCR 123

5.1.2 PCR产物的TA克隆 126

5.1.3 原位PCR 132

5.1.4 PCR法筛选cDNA文库 136

5.1.5 再生式序列复制反应(3SR) 139

5.1.6 PCR快速扩增(RACE)获得全长cDNA 141

5.2 应用PCR技术克隆未知基因 145

5.2.1 反转录(RT)-PCR 150

5.2.2 差别显示反转录(DDRT)-PCR 155

5.2.3 RNA的任意引物(RAP) -PCR 163

5.3 分子标记技术 164

5.3.1 DNA限制性片段长度多态性(RFLP)分析 166

5.3.2 随机扩增多态性(RAPD)分析 168

5.3.3 微卫星DNA多态性分析 171

6.1.1 离体器官直接再生不定芽的培养 174

6.1 植物组织培养再生体系的建立 174

6 基因表达与调控研究技术 174

6.1.2 愈伤组织培养 175

6.2 植物遗传转化体系的建立 176

6.2.1 农杆菌介导的转化 177

6.2.2 基因枪转化技术 179

6.2.3 电激转化技术 184

6.2.4 转基因植株的鉴定 185

6.2.5 外源目标基因在转基因植株中的表达 185

6.3 Southwestern法筛选转录因子cDNA的克隆 186

6.4 一步杂交法克隆DNA结合蛋白的cDNA 189

6.5.2 突变型(auxotroph)细胞的转化 193

6.6 真核细胞的基因在大肠杆菌中的表达 193

6.5 异源互补法筛选低丰度的基因 193

6.5.1 cDNA表达文库的构建 193

6.7 体外转录和翻译偶联检测法 197

6.8 凝胶阻滞分析 203

7 蛋白质的分离与分析 206

7.1 蛋白质的电泳技术 206

7.1.1 聚丙烯酰眩凝胶-等电聚焦电泳 206

7.1.2 蛋白质的双向电泳技术 208

7.1.3 高效毛细管电泳 212

7.2 植物同工酶电泳分析技术 217

7.3.1 免疫血清的制备 220

7.3 免疫分析技术 220

7.3.2 酶联免疫吸附测定 224

7.3.3 双向免疫扩散技术—-—平板法 227

7.4 薄层层析技术分离分析氨基酸 230

7.5 Western—印迹杂交 235

8 细胞生物学常用技术 243

8.1 植物细胞质膜的分离和纯化技术 243

8.2 植物细胞器标记酶的测定 248

8.3 植物细胞、组织或器官氧化还原活性的测定 250

8.4 植物原生质体的培养 252

8.5 植物组织中几种酶的组织化学定位鉴定 255

8.6 植物激素的提取和鉴定 259

8.7 放射免疫分析法测定几种激素 261

8.7.1 血清或血浆孕酮放射免疫测定法 261

8.7.2 组织中cAMP测定法(蛋白结合法) 263

8.7.3 血清雌二醇(Estradi01)的测定 265

8.7.4 人绒毛膜促性腺激素(HCG)的放免测定 266

8.8 显微摄影技 269

8.8.1 显微摄影装置 269

8.8.2 感光片的选择与应用 270

8.8.3 滤光镜的作用 271

8.8.4 黑白底片的冲洗 271

8.8.5 黑白照片放大 272

9.1 国际互联网(Internet)的应用概述 273

9 计算机技术在分子生物学中的应用 273

9.2 序列分析软件 275

9.3 引物评价的计算机软件 278

9.4 序列数据向数据库的传送 280

9.5 常用数据库及其软件 282

9.5.1 BLAST程序家族所适用的范围 282

9.5.2 用于BLAST程序的数据库 282

9.5.3 用于分子生物学的免费分析软件 283

9.5.4 分子生物学中常用的数据库 284

9.5.5 Internet上的生物学杂志及其网址 286

9.5.6 常用的分子生物学网址 287

1.2 常用核酸与蛋白质换算数据 289

1.3 DNA在溶液中的浓度 290

附录2 酶类 291

2.2 蛋白水解酶 291

2.1 溶菌酶 291

2.3 无DNA酶的RNA酶 291

3.1 常用缓冲液 292

3.2 电泳缓冲液 292

附录3 缓冲液 292

3.3 常用的凝胶加样缓冲液 293

3.4 测序凝胶加样缓冲液 294

附录4 与DNA凝胶电泳有关的数据 295

4.1 琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的分辨范围 295

4.2 聚丙烯酰胺凝胶浓度与线性DNA的分辨范围 295

4.3 染料在非变性聚丙烯酰胺疑胶中的迁移速度 295

4.4 染料在变性聚丙烯酰胺凝胶中的迁移速度 296

附录5 细菌培养基和抗生素 296

5.1 液体培养基 296

5.3 保存培养基 298

5.2 含有琼脂或琼脂糖的培养基 298

5.5 用于噬菌体操作的溶液 299

5.4 抗生素 299

1.1 常用核酸的长度与分子量 299

附录 299

附录1 有关核酸的常用数据 299

附录6 杂交实验中用于降低背景的封闭剂 300

6.1 Denhardt试剂 300

6.2 BLOTTO 301

6.3 肝素 301

6.4 经变性并被打断的鲑精DNA 301

附录7 分子生物学有毒试剂的净化处理和安全使用 301

附录8 图表目录 303

附录9 人类遗传疾病在染色体上的定位 307

附录10 酵母遗传学命名法 328

附录11 缩略语表 329