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实验计划表 1

导论 5

1 基因文库的构建 25

1-1 染色体DNA的提取 25

1-2 总RNA和mRNA的提取 33

1-3 λ噬菌体DNA的提取 40

1-4 染色体DNA的部分消化 46

1-5 基因组文库的构建 48

1-6 cDNA合成 52

1-7 cDNA文库的构建 58

2 目的基因的获得 64

2-1 PCR扩增 64

2-2 核酸电泳 74

2-3 目的基因片段的获得 81

2-4 核酸探针的标记及检测 83

2-5 核酸探针筛选基因文库 92

2-6 反转录PCR 97

2-7 RACE PCR 103

2-8 反向PCR 110

2-9 Sitefinding-PCR 114

3 载体质粒的制备 119

3-1 质粒DNA的提取与纯化 119

3-2 核酸纯度、浓度与相对分子质量的测定 128

4 扩增质粒的构建 133

4-1 限制性内切酶的酶切反应 133

4-2 凝胶电泳法进行DNA的分离与纯化 140

4-3 DNA片段的体外连接 143

4-4 T-A克隆 149

5 重组DNA导入宿主细胞 153

5-1 感受态细胞的制备 153

5-2 重组质粒的转化 158

5-3 外源基因在毕赤酵母中的转化与整合 163

6 重组子的筛选与鉴定 169

6-1 阳性克隆的筛选 169

6-2 DNA序列测定 175

6-3 序列同源性分析 181

6-4 DNA印迹 183

6-5 菌落原位杂交 193

6-6 荧光原位杂交 196

7 表达质粒的构建与诱导表达 201

7-1 表达质粒的构建与转化 201

7-2 RNA印迹 212

7-3 外源基因的诱导表达 217

7-4 蛋白质浓度的测定 222

7-5 SDS-PAGE 227

7-6 蛋白质印迹 236

8 蛋白质样品的分析 243

8-1 等电聚焦电泳 243

8-2 双向电泳 246

8-3 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 257

8-4 酶联免疫吸附测定（ELISA） 261

8-5 蛋白质生物功能测定 263

8-6 酶活性的测定 264

9 工程菌的培养与目的产物分离 267

9-1 发酵条件的优化 267

9-2 包含体的复性 270

9-3 诱导表达蛋白质的分离沉淀 274

9-4 凝胶过滤层析 281

9-5 离子交换层析 288

9-6 亲和层析 295

附录1 简写 303

附录2 实验注意事项 307

附录3 如何撰写实验报告 311

附录4 常用碱基、氨基酸符号及缓冲液 313

附录5 大肠杆菌基因型 316

附录6 培养基与试剂的配制 318

附录7 实验仪器 329

参考文献 331